无菌室的要求：

1、需要建立无菌室管理制度。

2、保持良好的卫生：相对湿度40%---60%，温度20—22 ℃，最好安装空调。

3、无菌室不得进行其他工作，非操作所使用的物件一律不得放入，检后的余样不得存放。

4、紫外灯的使用期限一般为300小时，要记录使用时间，到期更换。

无菌操作及要求

以菌落总数、大肠菌群为例演示无菌实验流程

对实验台、手、检验用具进行消毒（保证无菌环境和无菌实验用品），微生物的理想环境是无菌，但是更应该做好防护，保护自己。防护衣服，口罩手套必须佩带。

对实验的台面进行擦拭消毒，一般用75%乙醇或新洁尔灭溶液。

为保持无菌的进行，对手心手腕这些容易残留细菌的部位进行消毒处理。

实验台上面的药品、盛装样品的盒子等实验用工具要进行消毒处理。

实验前对培养基的检查、无菌条件下称样

1）实验前检查大肠菌群培养基的量、导气管内是否有气泡。

2）开启超净台风机、在无菌、空气缓慢流动状态下工作。

3）进行无菌称样，这一步其实最好是要佩带手套的。

4）接种针灭菌

5）接菌试管口灭菌

6）取菌

在接种或向培养皿内倒培养基时，试管口或瓶壁外面不要接触皿底，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。

总结

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因：

一是防止试验操作中人为污染样品；

二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

要求如下：

无菌室使用与管理要求

1.工作室应矮小、平整，面积小，高2.2-2.3米，内部装修应平整、光滑，无凹凸不平或棱角等，四壁及屋顶应用不透水之材质，便于擦洗及杀菌。

2.室内采光面积大，从室外应能看到室内情况。

3.为保证无菌室的洁净，无菌室周围需设缓冲走廊，走廊旁再设缓冲间，其面积可小于无菌室。

4.无菌室、缓冲走廊及缓冲间均设有日光灯及供消毒空气用紫外灯，杀菌紫外灯离工作台以1米为宜 ，其电源开关均应设在室外。

5.无菌室与缓冲间进出口应设拉门，门与窗平齐，门缝要封紧，两门应错开，以免空气对流造成污染。

6.无菌室的使用与管理

（1） 无菌室应保持清洁整齐，室内仅存放必须的检验用具如酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环等。不要放与检测无关的物品

（2） 室内检验用具及凳桌等保持固定位置，不随便移动。

（3） 每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。

（4） 定期检查室内空气无菌状况，细菌数应控制在10个以下，发现不符合要求时，应立即彻底消毒灭菌。无菌室无菌程度的测定方法：取普通肉汤琼脂平板、改良马丁培养基平板各3个（平板直径均9厘米），置无菌室各工作位置上，开盖曝露半小时，然后倒置进行培养，测细菌总数应置37℃温箱培养48小时；测霉菌数则应置27℃温箱培养5天。细菌、霉菌总数均不得超过10个为合格 。

（5） 无菌室杀菌前，应将所有物品置于操作之部位（待检物例外），然后打开紫外灯杀菌30分钟，时间一到，关闭紫外灯待用。

（6） 进入无菌室前，必须于缓冲间更换消毒过的工作服、工作帽及工作鞋。

（7） 操作应严格按照无菌操作规定进行，操作中少说话，不喧哗，以保持环境的无菌状态。

器材及场所的灭菌消毒

微生物检验用器材及场所必须进行灭菌或消毒处理，不同的对象采用不同的处理方法。

1. 高压蒸汽灭菌: 工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121℃灭菌半小时,当然不同的培养基有不同的要求,应分别处理。

2. 火焰灭菌： 接种针、接种环等可直接火焰灭菌。

3. 高温干燥灭菌： 各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃灭菌2小时。

4. 一 般消毒: 无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。

5. 空气的消毒： 开启紫外灯照射30-60分钟 即可。

准备工作

1. 先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。

2. 检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。

3. 操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好无菌工作衣、帽和鞋，才能进入无菌室。

4. 进入无菌室后再一次消毒手部，然后才进行检验操作。

操作过程注意事项

1. 动作要轻，不能太快，以免搅动空气增加污染；玻璃器皿也应轻取轻放，以免破损污染环境。

2. 操作应在近火焰区进行。

3. 接种环、接种针等金属器材使用前后均需灼烧，灼烧时先通过内焰，使残物烘干后再灼烧灭菌。

4. 使用吸管时，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必须用洗耳球操作。

5. 观察平板时不好 开盖，如欲沾取菌落检查时，必需靠近火焰区操作，平皿盖也不能 大开，而是上下盖适当开缝。

6. 进行可疑致病菌涂片染色时，应使用夹子夹持玻片，切勿用手 直接拿玻片，以免造成污染，用过的玻片也应置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗涤。

7. 工作结束，收拾好工作台上的样品及器材，最后用消毒液擦拭工作台。